Un sistema multifunzionale per l'editing del genoma e di grandi dimensioni

Nature Communications volume 13, numero articolo: 3430 (2022) Citare questo articolo

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CRISPR SWAPnDROP estende i limiti dell’editing genomico al trasferimento di DNA in vivo su larga scala tra specie batteriche. Il suo approccio a piattaforma modulare facilita l'adattamento specie-specifico per conferire l'editing del genoma in varie specie. In questo studio, mostriamo l'implementazione del concetto CRISPR SWAPnDROP per l'organismo modello Escherichia coli, il Vibrio natriegens a crescita rapida e il patogeno vegetale Dickeya dadantii. Dimostriamo l'escissione, il trasferimento e l'integrazione di grandi regioni cromosomiche tra E. coli, V. natriegens e D. dadantii senza estrazione intermedia del DNA che limita le dimensioni. CRISPR SWAPnDROP fornisce anche approcci comuni di modifica del genoma che comprendono inserimenti ed eliminazioni senza cicatrici, privi di marcatori, iterativi e paralleli. Il carattere modulare facilita le applicazioni della libreria del DNA e il riciclaggio di parti standardizzate. Il suo sistema di co-selezione multicolore senza scarsità migliora significativamente l'efficienza di editing e fornisce controlli di qualità visiva durante tutto il processo di assemblaggio e modifica.

Negli ultimi anni, l’importanza dell’editing genomico nei batteri è aumentata rapidamente nella ricerca di base, nella biotecnologia e nella biologia sintetica. Nuove tecnologie come CRISPR/Cas9 e la sintesi del DNA su larga scala hanno reso l’editing del genoma alla portata di un’ampia comunità scientifica. Tuttavia, le modifiche di grandi dimensioni, l’incompatibilità dei singoli strumenti e i sistemi ad alto rendimento rappresentano ancora una sfida.

I passaggi fondamentali dell'editing genomico nei batteri sono l'introduzione di DNA modello esogeno sotto forma di plasmidi, ssDNA o dsDNA e la successiva integrazione nel cromosoma tramite ricombinazione omologa. La ricombinazione omologa è un processo molto inefficiente, anche se migliorato con sistemi di ricombinazione come λRED. Sono state sviluppate diverse strategie per superare lo screening dispendioso in termini di tempo per le cellule modificate, ad esempio l'integrazione di marcatori di resistenza agli antibiotici o marcatori metabolici1,2,3,4. Tuttavia, il numero di modifiche possibili in una cella è limitato dal numero di marcatori disponibili poiché è possibile una sola modifica per marcatore. Inoltre, l'introduzione di ulteriori geni marcatori nel cromosoma può causare interferenze indesiderate con le unità di trascrizione adiacenti5,6. Per aggirare il problema della limitazione dei marcatori, vengono introdotte ricombinasi sito specifiche come la ricombinasi Cre e FLP per rimuovere il marcatore di selezione dopo l'integrazione cromosomica7,8. Ciò aggiunge un ulteriore passaggio al processo di modifica e lascia siti di ricombinazione attivi nel genoma, il che alla fine limita l'applicazione di questo approccio anche con l'uso di siti di ricombinazione alternativi9. Un'altra strategia per evitare marcatori di selezione e altre cicatrici è la sostituzione allelica oligo-mediata (OMAR). Il DNA corto a filamento singolo (ss) viene incorporato nel genoma da un evento di sostituzione allelica simile a Okazaki nella forca di replicazione e facilita mutazioni puntiformi, piccole delezioni e inserzioni10. L'automazione e la ciclizzazione di questo metodo consentono modifiche del genoma di diversi geni11. Tuttavia, OMAR è limitato dalla dimensione degli oligo ssDNA utilizzati e pertanto non sono possibili modifiche più grandi.

Per un editing genomico senza cicatrici più ampio, è possibile applicare metodi di controselezione. Tali metodi si basano su efficienti contro-selettori come le meganucleasi I-SceI e I-CreI, che introducono rotture del doppio filamento in un sito specifico di 18 e 22 bp di lunghezza12,13. La rottura del doppio filamento porta alla morte cellulare delle cellule non modificate. Ciò arricchisce fortemente la popolazione vitale per le celle modificate con successo. Tuttavia, l'approccio richiede un'ulteriore fase di editing classica, in cui il sito bersaglio delle meganucleasi viene prima integrato nel cromosoma nel sito di interesse.

La scoperta di CRISPR/Cas9 ha abolito l’integrazione iniziale di un sito di restrizione specifico. Simile a una meganucleasi, Cas9 è un'endonucleasi. A differenza di una meganucleasi, Cas9 non ha specificità di sequenza del DNA. La specificità è mediata da un RNA guida (gRNA) complementare alla sequenza target. I possibili siti target sono limitati solo dalla sequenza del motivo adiacente del protospacer (PAM) (5′-NGG-3′), che deve essere posizionata a monte della sequenza target. Grazie alla sua semplicità, la controselezione Cas9 è ampiamente utilizzata. I sistemi plasmidici che ospitano un Cas9 inducibile e un sistema di ricombinazione sono stati progettati per selezionare delezioni geniche, mutazioni puntiformi e brevi inserimenti14,15. Questi sistemi dipendono dalla trasformazione di oligonucleotidi sintetici o di DNA modello lineare a doppio filamento per la ricombinazione omologa e pertanto non sono adatti per l'inserimento di grandi dimensioni. Per superare i limiti dimensionali, REXER fornisce il DNA modello su un replicone episomiale16. Inserti fino a 100 kb vengono asportati in vivo da CRISPR/Cas9 per facilitare la ricombinazione λRED. La selezione avviene tramite marcatori di selezione positivi e negativi, che portano a cicatrici nel sito di integrazione e richiedono una precedente integrazione del primo set di marcatori di selezione.