Astrocita

Natura volume 616, pagine 764–773 (2023) Citare questo articolo

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Astrociti e neuroni interagiscono ampiamente nel cervello. Identificare i proteomi degli astrociti e dei neuroni è essenziale per chiarire le reti proteiche che determinano i rispettivi contributi alla fisiologia e alla malattia. Qui abbiamo utilizzato la biotinilazione1 dipendente dalla prossimità specifica della cellula e specifica del sottocompartimento per studiare i proteomi degli astrociti e dei neuroni striatali in vivo. Abbiamo valutato i compartimenti citosolici e della membrana plasmatica per astrociti e neuroni per scoprire come queste cellule differiscono a livello proteico nel loro meccanismo di segnalazione. Abbiamo anche valutato i compartimenti subcellulari degli astrociti, compresi i piedi terminali e i processi fini, per rivelare i loro sottoproteomi e le basi molecolari della segnalazione essenziale degli astrociti e delle funzioni omeostatiche. In particolare, SAPAP3 (codificato da Dlgap3), che è associato al disturbo ossessivo-compulsivo (DOC) e a comportamenti ripetitivi2,3,4,5,6,7,8, è stato rilevato ad alti livelli negli astrociti striatali ed è stato arricchito all'interno di specifici astrociti sottocompartimenti dove regolava l'organizzazione del citoscheletro di actina. Inoltre, esperimenti di salvataggio genetico combinati con analisi comportamentali e valutazioni molecolari in un modello murino di disturbo ossessivo compulsivo privo di SAPAP3 hanno rivelato contributi distinti di SAPAP3 astrocitico e neuronale a fenotipi simili a disturbo ossessivo compulsivo ripetitivi e correlati all'ansia. I nostri dati definiscono come gli astrociti e i neuroni differiscono a livello proteico e nelle loro principali vie di segnalazione. Inoltre, rivelano come i sottoproteomi degli astrociti variano tra i sottocompartimenti fisiologici e come sia i meccanismi SAPAP3 degli astrociti che quelli neuronali contribuiscono ai fenotipi del disturbo ossessivo compulsivo nei topi. I nostri dati indicano che le strategie terapeutiche che mirano sia agli astrociti che ai neuroni possono essere utili da esplorare nel disturbo ossessivo compulsivo e potenzialmente in altri disturbi cerebrali.

Gli astrociti sono il tipo predominante di glia nel sistema nervoso centrale e si sono evoluti insieme ai neuroni9. Gli astrociti sono componenti vitali del cervello10 e, come i neuroni, mostrano morfologie e proprietà che differiscono tra le regioni del cervello11,12,13,14. Sia gli astrociti che i neuroni sono ampiamente implicati nelle malattie cerebrali15, compresi i disturbi psichiatrici. Tuttavia, si sa poco sui meccanismi molecolari astrocitici e neuronali condivisi o separati e sui loro rispettivi contributi all'interno delle regioni cerebrali rilevanti per malattie psichiatriche o fenotipi definiti nei topi.

Neuroni e astrociti interagiscono anatomicamente e fisiologicamente, anche all'interno dello striato16,17. Nel contesto della fisiologia e della malattia, la maggior parte degli studi ha confrontato astrociti e neuroni utilizzando metodi neuropatologici, fisiologia, marcatori cellulari o analisi dell'espressione dell'RNA. Per quanto riguarda l'RNA, sebbene inestimabile, la relazione tra i livelli di espressione dell'RNA e i livelli delle proteine18 è altamente complessa; pertanto, è fondamentale identificare specifici meccanismi basati sulle proteine ​​per neuroni e astrociti19. Inoltre, per comprendere la biologia di base degli astrociti e dei neuroni, è necessario catturare le identità delle proteine ​​e le loro differenze all’interno delle cellule morfologicamente intatte. Le procedure di dissociazione cellulare e di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) tagliano la maggior parte dei processi astrocitari e neuronali e sono particolarmente dannosi per gli astrociti che normalmente rispondono allo stress tissutale20,21,22, viziando l'uso di questi metodi per la proteomica. Di conseguenza, i proteomi degli astrociti e dei neuroni non sono stati misurati, confrontati o utilizzati direttamente per comprendere il loro contributo ai fenotipi rilevanti nella fisiologia o nelle malattie psichiatriche in nessuna specie.

Lo striato è il nucleo più grande dei gangli della base, un gruppo di nuclei sottocorticali coinvolti nel movimento, nelle azioni e in diverse condizioni neuropsichiatriche23,24,25. Lo striato contiene estesi contatti tra astrociti e neuroni, il 95% dei quali sono neuroni spinosi medi (MSN) DARPP32 positivi16. Poiché gli astrociti perdono la loro morfologia complessa in seguito alla dissociazione (dati estesi Fig. 1a-d), abbiamo caratterizzato la composizione di proteomi specifici del tipo di cellula (astrociti e neuroni) e compartimenti (citosolico e membrana plasmatica (PM)) utilizzando biotina ligasi geneticamente mirata (BioID2; Extended Data Fig. 2a,b) somministrato in vivo all'interno dello striato utilizzando virus adeno-associati (AAV; Extended Data Fig. 2b,c). Questo metodo non utilizza la dissociazione cellulare o FACS. BioID2 biotinila le proteine ​​nei residui di lisina liberi in presenza di biotina1,26. Dopo aver caratterizzato il BioID2 citosolico e i costrutti LCK-BioID2 mirati al PM nelle cellule HEK-293 (Extended Data Fig. 3), abbiamo somministrato selettivamente BioID2 o LCK-BioID2 agli astrociti o ai neuroni utilizzando un promotore GFAP troncato (GfaABC1D) o un promotore SYN1 umano27 e AAV con tropismo preferito di astrociti (Astro) o neuroni (Neuro), rispettivamente (Fig. 1a e Dati estesi Fig. 2c-h). Astro BioID2, Astro LCK-BioID2 e le proteine ​​​​che hanno biotinilato sono state rilevate solo negli astrociti cespugliosi S100β-positivi, compresi all'interno dei piedi terminali (Dati estesi Fig. 4a-d). Al contrario, Neuro BioID2, Neuro LCK-BioID2 e le loro proteine ​​biotinilate sono state rilevate all'interno di somi neuronali DARPP32-positivi e nel neuropilo, che riflettevano rispettivamente la loro espressione assonale e dendritica (Dati estesi Fig. 4e-h). Le analisi Western blot hanno confermato la biotinilazione (Extended Data Figg. 2e-h e 4; P <0,01 in ciascun caso), che ha consentito l'identificazione delle proteine ​​mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).