Il panorama dell’ubiquitinazione della polimerasi del virus dell’influenza A

Nature Communications volume 14, numero articolo: 787 (2023) Citare questo articolo

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Durante le infezioni da virus dell'influenza A (IAV), le proteine ​​virali vengono prese di mira dalle ligasi E3 cellulari per la modifica con l'ubiquitina. Qui, decifichiamo ed esploriamo funzionalmente il panorama dell'ubiquitinazione delle proteine ​​della polimerasi IAV durante l'infezione delle cellule epiteliali alveolari umane applicando l'analisi della spettrometria di massa di peptidi immuno-purificati con residuo K-ε-GG (di-glicile). Abbiamo identificato 59 lisine modificate nelle tre subunità, PB2, PB1 e PA della polimerasi virale, di cui 17 influenzano distintamente la trascrizione dell'mRNA, la replicazione del vRNA e la generazione di virus ricombinanti attraverso meccanismi non proteolitici. Inoltre, ulteriori analisi funzionali e in silico indicano che l'ubiquitinazione a K578 nel dominio del pollice PB1 è meccanicamente collegata alle transizioni strutturali dinamiche della polimerasi virale necessarie per la replicazione del vRNA. Le mutazioni K578A e K578R influenzano in modo differenziale la generazione di virus ricombinanti impedendo la sintesi di cRNA e vRNA, il legame NP e la dimerizzazione della polimerasi. Collettivamente, i nostri risultati dimostrano che la neutralizzazione della carica mediata dall'ubiquitina in PB1-K578 interrompe l'interazione con un ciclo non strutturato nell'N-terminale PB2 necessario per coordinare la dimerizzazione della polimerasi e facilitare la replicazione del vRNA. Ciò fornisce la prova che l’IAV sfrutta il sistema cellulare dell’ubiquitina per modulare l’attività della polimerasi virale per la replicazione virale.

I virus dell’influenza A (IAV) sono patogeni respiratori della famiglia Orthomyxoviridae che rappresentano una minaccia sostanziale per la salute globale attraverso epidemie stagionali e pandemie ricorrenti. Il genoma IAV è costituito da otto segmenti di RNA a filamento singolo (vRNA) con senso negativo. Ciascun vRNA è incapsidato da più copie della nucleoproteina (NP) e da una copia della RNA polimerasi trimerica virale RNA-dipendente (RdRP), composta dalle subunità PB2, PB1 e PA1,2 per formare complessi di ribonucleoproteina virale (vRNP)3. La trascrizione degli mRNA virali e la replicazione del genoma virale è mediata dagli RdRP e avviene nel nucleo della cellula. Mentre i vRNP in arrivo sono in grado di eseguire direttamente la sintesi dell'mRNA in seguito allo strappo del cappuccio dai pre-mRNA derivati ​​dall'ospite4,5,6, la replicazione del vRNA dipende dalle proteine ​​virali e dai complessi della polimerasi di nuova produzione. Procede in modo indipendente dai primer e comporta la generazione di intermedi RNA complementari (cRNA) a senso positivo a lunghezza intera, che fungono da modelli per la sintesi di vRNA7.

Le indagini strutturali hanno rivelato che l'IAV RdRP è un complesso proteico flessibile e altamente dinamico che adotta diverse conformazioni durante la trascrizione dell'mRNA e la replicazione del vRNA5,8. L'attuale modello per la replicazione del vRNA suggerisce che la transizione dalla trascrittasi alla replicasi è promossa dall'interazione con una seconda polimerasi virale che forma un dimero asimmetrico9,10. Inoltre, la formazione del dimero asimmetrico facilita l’incapsidazione del nascente filamento di cRNA. Nella seconda fase della replicazione del genoma, l'inizio della sintesi di vRNA da modelli di cRNA richiede la formazione di un dimero simmetrico della polimerasi attraverso l'interazione con una polimerasi trans-attivante11,12. Per mantenere l'equilibrio ottimale tra trascrizione dell'mRNA e replicazione del vRNA durante il ciclo di vita virale, l'assemblaggio cronologico dei due dimeri è fondamentale e si suggerisce che sia influenzato da fattori virali e cellulari. In particolare, le modifiche post-traduzionali mediate dall'ospite (PTM) delle proteine ​​virali sono state proposte come interruttori molecolari dinamici per mettere a punto le azioni del RdRP13,14. Infatti, la fosforilazione15,16,17,18,19, la ribosilazione o l'acetilazione dell'ADP19,20,21 nonché il collegamento dell'ubiquitina (UB)22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 e Sono stati segnalati modificatori simili all'ubiquitina (UBL), come SUMO 1–332,33, NEDD834 o ISG1535 alle subunità della polimerasi e NP. Tra questi modificatori, l'ubiquitinazione è il più abbondante nelle cellule umane e regola la funzionalità e la longevità di un'ampia gamma di proteine ​​ed è stata descritta per tutte le subunità dell'IAV RdRP con risultati sia pro che antivirali. La coniugazione di PTM come UB conferisce diversi effetti. Introduce una superficie di legame per altre proteine ​​che legano UBL, ma può anche proteggere i siti di legame delle proteine ​​sulla proteina modificata. Inoltre, l'UB trasferisce segnali biologici, ad esempio la degradazione da parte del proteasoma cellulare o la traslocazione in un diverso compartimento cellulare. Una conseguenza meno segnalata del collegamento UB è la neutralizzazione della carica positiva nella catena laterale dell'accettore di lisina mediante la formazione del legame dipeptidico, che può provocare alterazioni strutturali e influenzare le interazioni con altre proteine36. Fino ad oggi, l’impatto biologico delle modifiche sito-specifiche nelle proteine ​​della polimerasi IAV per i processi di trascrizione dell’mRNA virale e di replicazione del genoma è rimasto in gran parte sconosciuto.