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Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 18 (2023) Citare questo articolo

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È noto che l’esercizio aerobico promuove la neuroplasticità e la memoria dell’ippocampo. Nel cervello in via di sviluppo, l’esercizio fisico nei primi anni di vita (ELE) può portare a miglioramenti persistenti nella funzione dell’ippocampo, ma i meccanismi molecolari alla base di questo fenomeno non sono stati completamente esplorati. In questo studio, topi transgenici che ospitano la cassetta "NuTRAP" (Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification) nei neuroni che esprimono Emx1 (topi "Emx1-NuTRAP") vengono sottoposti a ELE durante l'adolescenza. Quindi isoliamo e sequenziamo simultaneamente l'mRNA di traduzione e la cromatina nucleare da singoli omogenati ippocampali contenenti neuroni che esprimono Emx1. Questo approccio ci ha permesso di accoppiare dati di sequenziamento translatomico con epigenomico per valutare l'influenza delle modifiche istoniche H4K8ac e H3K27me3 sulla traduzione dell'mRNA dopo ELE. Un sottogruppo di topi ELE è stato sottoposto a un compito di apprendimento dell'ippocampo per determinare l'espressione genetica e le basi epigenetiche del contributo di ELE al miglioramento delle prestazioni della memoria dell'ippocampo. Da questo esperimento scopriamo le relazioni tra espressione genica e modificazione degli istoni che possono svolgere un ruolo critico nella memoria facilitata dopo ELE. I nostri dati rivelano potenziali interazioni di modificazione gene-istone e implicano percorsi di regolazione genetica coinvolti nell'impatto dell'ELE sulla memoria dell'ippocampo.

Le esperienze ambientali attivano meccanismi epigenetici per modulare l'espressione genica e la funzione cellulare nei neuroni post-mitotici1,2. Le modifiche degli istoni e la metilazione del DNA sono particolarmente importanti per l'adattamento neuronale ai segnali ambientali alterando la trascrizione e la funzione sinaptica3,4. È stato dimostrato che risultati comportamentali come la suscettibilità allo stress, la ricerca di ricompense e la memoria a lungo termine comportano cambiamenti nell'accessibilità della cromatina e nell'espressione genica nei neuroni5,6,7,8,9. Oltre a ciò, il paesaggio della cromatina neuronale subisce ondate di modifiche epigenetiche in funzione della maturazione cerebrale stessa10,11,12. Periodi postnatali di elevata sensibilità agli stimoli ambientali possono portare a cambiamenti duraturi nella funzione cellulare e possono derivare da meccanismi epigenetici temporalmente specifici nel cervello in via di sviluppo13,14. Se i meccanismi di regolazione genetica nei neuroni postmitotici siano influenzati in modo univoco dalle esperienze dei primi anni di vita per informare la funzione a lungo termine è una questione che sta appena iniziando ad essere esplorata. Identificare i processi epigenetici coinvolti nella modulazione della funzione neuronale, in particolare durante lo sviluppo del cervello, è fondamentale per comprendere come le esperienze dei primi anni di vita influiscono sui risultati comportamentali a lungo termine.

L'esercizio aerobico migliora le prestazioni nei compiti cognitivi che coinvolgono l'ippocampo sia negli esseri umani adulti che nei modelli animali15,16. Il tipo, i tempi e la durata dell'esposizione all'esercizio sono importanti per stabilire se ha un impatto persistente sulla funzione dell'ippocampo17,18,19. I risultati ottenuti nei roditori sia adolescenti che adulti implicano un ruolo degli enzimi che modificano gli istoni nei meccanismi dei benefici indotti dall'esercizio fisico sulla memoria dell'ippocampo. Sia l'esercizio volontario che il trattamento con un inibitore dell'HDAC3 abilitano la memoria dell'ippocampo dopo uno stimolo di apprendimento sottosoglia, aumentano l'espressione genica del fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) e promuovono l'acetilazione di H4K8 nei promotori di specifici esoni BDNF20,21,22. Ciò suggerisce che l’esercizio attiva meccanismi di regolazione epigenetica per promuovere la plasticità dell’ippocampo. È interessante notare che l'esercizio negli adulti apre anche una finestra temporale per miglioramenti persistenti nelle prestazioni della memoria dell'ippocampo quando viene introdotta un'esposizione all'esercizio riattivante23, suggerendo una "memoria molecolare" dell'esercizio iniziale23. Sebbene molti di questi studi siano stati condotti sugli adulti, studi più recenti dimostrano che gli effetti dell'esercizio sulla memoria dell'ippocampo, sulle alterazioni nell'espressione dei fattori neurotrofici, sulla plasticità sinaptica e sulla neurogenesi sono simili nei periodi giovanile e adolescenziale17,24,25,26,27 . Precedenti risultati del nostro laboratorio dimostrano che l'esercizio nei primi anni di vita (ELE) per una settimana (periodo giovanile; giorni postnatali (P) 21–27) o tre settimane (adolescenza giovanile; P21–41) facilita la formazione della memoria a lungo termine dell'ippocampo in risposta a uno stimolo di apprendimento tipicamente insufficiente per formare la memoria a lungo termine. Questo risultato è stato associato ad un aumento del potenziamento a lungo termine (LTP) e alle modulazioni della fisiologia sinaptica nel CA117 dell'ippocampo. In particolare, gli effetti sulla memoria dell’ippocampo dell’ELE giovanile persistevano due settimane dopo la cessazione dell’esercizio, che è potenzialmente più lungo dell’effetto dell’esercizio sulla funzione dell’ippocampo adulto23. Prendendo insieme questi risultati, è possibile che l'esercizio (sia nella prima infanzia che nell'età adulta) possa "innescare" la funzione dell'ippocampo per risposte facilitate a esperienze future (come futuri periodi di esercizio o eventi di apprendimento dell'ippocampo). I meccanismi epigenetici sono forti candidati per gli effetti priming dell’esercizio in quanto l’epigenoma potrebbe rappresentare una memoria molecolare dell’esperienza dell’esercizio preparando il panorama della cromatina per un’espressione genica efficiente, modulando così la funzione neuronale e l’output comportamentale22. I meccanismi specifici alla base degli effetti comportamentali ed elettrofisiologici sostenuti dell'ELE non sono stati valutati dal punto di vista di una potenziale memoria molecolare dell'ELE all'interno dell'epigenoma.

8 for all samples, average yield RNA = 14.367 ng/ul; Supplementary Data 2)28. INTACT-isolated nuclei were further processed using the cleavage under targets and release using nuclease (CUT&RUN38) method to isolate antibody-specific protein-DNA interactions for downstream DNA sequencing. The resulting DNA libraries were of high quality and concentration when using specific antibodies (H4K8ac: average size = 1238 bp, average concentration = 126.8 nM; H3K27me3: average size = 1032 bp, average concentration = 146.5 nM; Supplementary Data 2). In contrast, the resulting DNA libraries using the non-specific IgG control had substantially lower concentrations (IgG: average size = 1035 bp, average concentration = 24.2 nM; Supplementary Data 2) further indicating that nuclear DNA from both isolations was of high starting quality./p> 8 for all samples; Simultaneous isolations: average RNA concentration = 14.367 ng/ul, RIN > 8 for all samples; Supplementary Data 2). The average RNA yield from the separate isolations (using a unilateral hippocampus) was approximately equal to half of the average yield of the simultaneous isolations (which combined bilateral hippocampi; Supplementary Data 2). Similarly, the final library concentrations for the separately isolated IgG CUT&RUN-seq libraries were also approximately half the concentration of the simultaneous isolations (average simultaneous: 24.2 nM, average separate: 11 nM; Supplementary Data 2). We interpret this to mean that nuclear DNA was fully intact in the simultaneous isolation because we did not obtain substantially more than double the concentration in the simultaneous vs separate isolations. Unilateral hippocampal homogenates yielded sufficient sequencing concentrations and quality to allow for library preparations from individual mice (Supplementary Data 2)./p>0.5 and p value < 2.2 × 10−16 (R = 1, p < 2.2 × 10−16; Fig. 2a). Next, CUT&RUN-seq was used to identify genomic regions interacting with two histone post-translational modifications (PTMs) of interest in the exercise and hippocampal memory fields: H4K8ac, a permissive histone mark associated with active transcription, or H3K27me3, a generally repressive histone PTM. We again applied Spearman's correlation to understand whether the simultaneous vs separate INTACT isolation methods could influence CUT&RUN-seq peak distribution. We compared normalized count data for CUT&RUN-seq peaks across a representative chromosome (chromosome 2). We binned 100 bp increments along the entire chromosome from the simultaneous and separate isolations using datasets generated from sedentary mice in our study. Normalized sequencing counts, which reflected reads assigned to binned genomic regions along chromosome 2, were highly similar between separate vs simultaneous conditions (H4K8ac: R = 0.65, p < 2.2 × 10−16; H3K27me3: R = 0.81, p < 2.2 × 10−16; Fig. 2b, c). Taken together, these experiments suggest that translating mRNA and nuclear DNA isolated from hippocampal homogenates using either simultaneous or separate isolation procedures are comparable in terms of quality, concentration, functional characterization, and normalized sequencing reads./p>0.5 and p value < 2.2 × 10−16; Fig. 3g–i). Overall, left and right hippocampal hemispheres did not demonstrate significant differences in normalized sequencing counts and peak distributions in the sedentary condition, suggesting that choice of hippocampal hemisphere is a less important factor to consider in obtaining representative data from the translatome and transcriptional regulation via histone modifications./p>30% expression increase with a p value < 0.05) our TRAP-seq revealed 297 upregulated and 338 downregulated hippocampal genes resulting from ELE (Fig. 4a and Supplementary Data 3). Many of the genes upregulated after ELE are known to be involved in exercise and/or hippocampal memory mechanisms, including Bdnf44 and Nr4a145. To functionally categorize ELE-induced DEGs, we performed a Panther Gene Ontology (GO) analysis46 focusing on the Molecular Function categorization and separated by upregulated and downregulated genes. Regardless of gene expression directionality, GO term categories with the most genes functionally assigned to them were "binding", "catalytic activity", "molecular function regulator", "transporter activity", "molecular transducer activity", and "structural molecule activity" (Fig. 4b). Many of the upregulated genes driving these categories are known to have critical roles in neuronal function (Kcna1, Slc24a4, Stxbp5l, Gabra2, and Camk2n2), neurodevelopment (Artn, Kdm7a, Sox21, Gap43, and Efna5), and hippocampal memory (Bdnf, Nr4a1 and Dusp5)./p>0.3785 and p-value < 0.05). b Panther Gene Ontology: Molecular Function top terms by most genes assigned. c Top 6 "Upstream Regulators" identified by Ingenuity Pathway Analysis (IPA). d Representative Gene Set Enrichment Analysis: Reactome leading-edge diagrams showing genes upregulated (d) or downregulated (d′) in ELE, and their categories of enrichment. *Abbreviated terms in d: (1) "transport of mature mRNAs derived from intronless transcripts", d′: (2) "activation of the mRNA upon binding of the cap binding complex and EIFs and subsequent binding to 43S", (3) srp-dependent cotranslational protein targeting to membrane, and (4) response of eif2ak4 gcn2 to amino acid deficiency./p>

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