Visualizzazione dell'attività del sistema nervoso enterico attraverso la tintura

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 236 (2023) Citare questo articolo

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Sono stati raggiunti importanti progressi nelle tecnologie di imaging, ma la maggior parte degli approcci metodologici attualmente utilizzati per studiare le funzioni neuronali enteriche si basano su coloranti di contrasto esogeni che possono interferire con le funzioni cellulari o la sopravvivenza. Nel presente articolo, abbiamo studiato se la tomografia a coerenza ottica a campo pieno (FFOCT) potrebbe essere utilizzata per visualizzare e analizzare le cellule del sistema nervoso enterico. Il lavoro sperimentale su preparazioni complete di colon di topo non fissati ha dimostrato che la FFOCT consente la visualizzazione della rete del plesso mienterico mentre la FFOCT dinamica consente di visualizzare e identificare singole cellule in situ nei gangli mienterici. Le analisi hanno inoltre dimostrato che il segnale dinamico FFOCT potrebbe essere modificato da stimoli esterni come la veratridina o da cambiamenti nell'osmolarità. Questi dati suggeriscono che la FFOCT dinamica potrebbe essere di grande interesse per rilevare cambiamenti nelle funzioni dei neuroni enterici e della glia in condizioni normali e patologiche.

Il sistema nervoso enterico (ENS) è una rete neuronale integrata presente all'interno del tratto gastro-intestinale (GI). Composto da neuroni e cellule gliali enteriche (EGC), l'ENS regola le funzioni gastrointestinali chiave che comprendono la motilità, la secrezione della mucosa, la proliferazione cellulare, la riparazione dei tessuti, ma anche le funzioni immunitarie1. Difetti nell'organizzazione e nelle funzioni del SNE contribuiscono a varie disfunzioni gastrointestinali osservate in un ampio spettro di disturbi digestivi ed extradigestivi2.

Negli ultimi anni sono state sviluppate tecniche di imaging microscopico per comprendere meglio le funzioni dell’ENS in condizioni normali e anormali. Ad esempio, sono stati compiuti progressi combinando tecniche microscopiche ad alta risoluzione con sonde fluorimetriche come coloranti sensibili al calcio o al voltaggio3. Ulteriori informazioni sull'organizzazione e sul sistema vascolare dell'ENS sono state fornite anche da tecnologie come la microscopia a foglio luminoso e la tomografia a proiezione ottica, che consentono l'analisi di sezioni di pochi centimetri quadrati di tessuto digestivo asportato4,5. Tuttavia, questi approcci tecnici possono essere eseguiti solo ex vivo poiché richiedono la pulizia dei tessuti e la colorazione immunoistochimica. La visualizzazione in vivo dell'ENS umana è stata ottenuta utilizzando l'endomicroscopia confocale con sonda (pCLE), ma poiché la risoluzione e la profondità di penetrazione erano troppo basse, è stata necessaria la dissezione endoscopica della sottomucosa6 o la colorazione con viola cresilico6 per ottenere un'immagine chiara dell'ENS7. In questo contesto, sono di grande interesse le nuove tecnologie che forniscono un'elevata risoluzione spaziale e un'imaging dinamico senza coloranti dell'ENS.

A questo proposito, la tomografia a coerenza ottica (OCT) può essere molto utile poiché consente l'imaging delle strutture interne dei tessuti mediante analisi interferometrica della luce retrodiffusa e riflessa8. Questa tecnologia ad alta velocità e non invasiva si basa sul contrasto intrinseco del tessuto per creare la ricostruzione volumetrica del tessuto. Questa strategia di imaging è ampiamente utilizzata per diagnosticare malattie dell'occhio umano9, ma se combinato con una sonda a fibra ottica, l'OCT può acquisire immagini nel sistema cardiovascolare, respiratorio o digestivo10. Nell'intestino, l'OCT endoscopico è stato generalmente utilizzato per la diagnosi dell'esofago di Barrett11 e sono stati ottenuti dati preliminari per altre indicazioni come le malattie infiammatorie intestinali e il cancro del colon-retto12,13. L'OCT endomicroscopico in vivo con una risoluzione tipica di decine di micron14 ha una risoluzione troppo bassa per visualizzare l'ENS, ma è possibile ottenere una risoluzione più elevata con due implementazioni di questa tecnica: FFOCT15,16 e SD-OCT ad alta risoluzione17,18,19. In questo articolo presentiamo i risultati ottenuti con il FFOCT, che acquisisce immagini 2D en face utilizzando obiettivi ad alta apertura numerica e luce visibile. Permette la generazione di immagini con risoluzione micrometrica e subcellulare ed è possibile raccogliere dati volumetrici anche modificando la profondità di acquisizione dell'immagine OCT en face. La sua applicazione è stata esplorata principalmente per il rilevamento dei margini tumorali intraprocedurali in vari organi20, compreso il cervello21. È stato segnalato anche per l'imaging delle strutture oculari22,23. Nonostante alcuni sforzi iniziali24, lo sviluppo di una versione endoscopica della FFOCT non è stato finora raggiunto. Nei campioni ex vivo dell'intestino, la FFOCT ha dimostrato la sua capacità di acquisire immagini del plesso mienterico nel tratto gastrointestinale del topo e dell'uomo25. Tuttavia, questo metodo di imaging non visualizza i neuroni e le cellule gliali nei gangli enterici, in parte a causa dei forti segnali di retrodiffusione prodotti dai tessuti circostanti come le cellule muscolari o dal SNE e della presenza di un rumore maculato. Un nuovo strumento chiamato FFOCT dinamico (D-FFOCT) ha notevolmente migliorato il contrasto cellulare nei tessuti complessi, analizzando le fluttuazioni temporali della luce retrodiffusa dai tessuti e dalle cellule26. Per l'analisi temporale del micromovimento dei costituenti cellulari, che è alla base del contrasto intrinseco del D-FFOCT, i segnali OCT vengono raccolti nel tempo dallo stesso piano di imaging, il che a sua volta riduce anche il rumore aggiuntivo e migliora la qualità dell'immagine. Il contrasto dinamico è stato implementato anche nella tecnologia SD-OCT ad alta risoluzione, che fornisce immagini in sezione trasversale del tessuto, rispetto al piano di imaging en face del D-FFOCT27. Micro-OCT con contrasto dinamico è stato utilizzato per la visualizzazione della microanatomia delle vie aeree28, della cervice e dell'esofago29. Gli sforzi recenti si concentrano sull'ulteriore miglioramento della velocità di acquisizione e della qualità dell'immagine di D-FFOCT e micro-OCT con contrasto dinamico per consentire l'imaging in vivo30,31,32. Allo stesso tempo, la tecnologia micro-OCT è stata tradotta con successo in un design endoscopico33,34. È stato presentato il progetto preliminare dell'endoscopio micro-OCT con contrasto dinamico35, ma la sfida della stabilizzazione dei tessuti durante la lunga acquisizione dei dati necessaria per estrarre il contrasto dinamico rimane una delle principali limitazioni. Anche i meccanismi cellulari alla base delle fluttuazioni temporali dei segnali OCT rimangono sconosciuti, ma i cambiamenti nell'attività metabolica cellulare potrebbero essere parzialmente responsabili poiché l'inibizione dell'attività mitocondriale utilizzando il rotenone o della glicolisi utilizzando il 2-desossi-D-glucosio ha ridotto significativamente l'intensità del segnale OCT26. È interessante notare che le singole cellule epiteliali o immunitarie che non potevano essere identificate individualmente mediante FFOCT, potevano essere visualizzate mediante D-FFOCT36. Ciò è incoraggiante, ma ad oggi non si sa nulla sulla capacità del D-FFOCT di visualizzare l'ENS o sui meccanismi biologici alla base dei segnali D-FFOCT dalle cellule dell'ENS.